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果胶酶发酵合成及其诱导植物抗病性研究pdf

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  果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究.pdf

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  摘 要 从情况平分离筛选了一株果胶酶高产菌株草酸青霉BZH-2002和一株黑曲霉 菌株PE-1650。别离优化了它们的果胶酶高产率固态发酵前提,草酸青霉 BZH-2002的内切果胶酶产率可达1.2X1护u/g甜菜渣。黑曲霉PE-1650的内切 果胶酶产率可达1.5X100u/g甜菜渣。 用甜菜渣粉末制备了果胶酶亲和吸附剂,别离用亲和层析、离子互换柱层析、 凝胶过滤柱层析等方式分手纯化了草酸青霉BZH-2002果胶酶,获得三种均一组 分,都有内切聚半乳糖醛酸酶活性,分子量都是41kD,它们的Km值别离为: endo-PGI为0.78mg/ml.endo-PGII为1.2mg/ml,endo-PGIII为2.0mg/ml,它 们的最适反映温度和pH各不不异。用阴离子互换柱层析和凝胶过滤部门纯化了 黑曲霉果胶酶粗酶液,获得内切聚半乳糖醛酸酶和内切果胶裂解酶组分。 别离用溜曲霉827.黑曲霉PE-1650、草酸青霉BZH-2002等菌株发酵合成 的果胶酶喷雾处置黄瓜和番茄幼苗,均诱导了植株广谱的抗病性。果胶酶诱导植 物抗病结果随利用浓度的添加而加强,并有必然的持效期。果胶酶诱导的黄瓜幼 苗组织中过氧化物酶显著添加,而且分歧果胶酶诱导的过氧化物同功酶变化不 同 巴西蘑菇、香菇以及霉菌菌丝体和抱子的提取物都具有诱导动物抗病的激发 子活性。成立了用黄瓜黄化苗快速筛选激发子活性物质的方式。 设想了果胶酶固态发酵出产工艺,以甜菜渣、硫酸按、磷酸盐为次要原料进 行固态发酵,发酵后熟物用水浸提果胶酶,离心分手残渣,微滤除去菌体,超滤 浓缩酶液 (浓缩液即为半成品),超滤透过液回用浸提果胶酶,离心后残渣用于 配制饲料。该工艺根基不排放废水、废渣,属于洁净出产工艺。 环节词:草酸青霉 果胶酶 激发子 诱导抗病性 固态发酵 StudyonFermentationofPectinasesandElicitationofPlant DiseaseResistance ZhihuiBai(EnvironmentalScienceandTechnology) DirectedbyProf.HongxunZhang Abstract PenicillumoxalicumBZH-2002andAspergillusnigerPE-1650withahigh pectinasesproductivitywereisolatedfromsoilenvironment.Thecultureconditions forpectinasesproductionwereoptimized.The如eldofendo-pectinasescouldreachto 1.2X105u/gsugarbeetpulprfomP.oxalicumBZH-2002,and1.5X104u/gsugar beetpulpfromA.nigerPE-1650. Theaffinitychromatographicadsorbentsforpectinaseswaspreparedusingsuger beetpulppowder.ThepectinasesfromPoxalicumBZH-2002waspurifiedbythe affinitychromatography,CM-celluloseCM52columnchromatographyandSephadex G-100gelfiltration.Threeendo-polygalacturonases(endo-PG)werepurifiedto homogeneity.Themolecularweightofthemare41kD.TheKmofendo-PGIis0.78 mg/ml,endo-PGIIis1.2mg/ml,andendo-PGIIIis2.0mg/ml.Theoptimalreaction temperatureandpHofthemaredifferent.Theendo-PGandendo-pectatelyasesrfom A.nigerPE-1650wereonlypartiallypurified,butrfeerfomcellulaseandxylanaseby Express-ionDcolumnchromatography,andSephadexG-100gelfiltration. ThepectinasesrfomAspergillustamarn827,A.nigerPE-1650,P.oxalicum BZH-2002,etal.wereseparatelysprayedoncucumberandtomatoplants.Allofthem inducedplantdiseaseresistance.Theinducedresistanceofcucumberwasincreased withtheconcentrationofpectinasesincreased.Theperoxidasesincucumberleaves wereremarkablyincreasedwhenthecucmberplantswereinducedbypectinases.The changesofisoenzymeoftheperoxidasesweredifferentwhenplantswereinducedby differentpectinases.Thewaterextractivesrfomtherfuitbodiesofmushroomesand microbialfungiwerealsoelicitorsforinducingplantdiseaseresistance.Themethod forrapidlydetectingelicitorswasdevelopedusingetiolatedseedlingsofcucumber. Thetechnologicalprocessforpectinasesproductionwasdeveloped.Pectinases wereproducedbysolidstatefermentationusingsugarbeetpulp,(NH4)2SO4and phosphate.Thentheculturemediawereextractedbywater,centrifuged,filtratedby micro-membrane,concentratedbysuperfiltration.Theliquidthroughsuperflitration couldbereappliedforextractingpectinasesrfomculturemedium,andtheresiduals producedcouldbeusedasanimalfeed.Sotherewasnowasteandwastewater discharginginthisprocess. Keywords:Penicillumoxalicum pectniases elicitor plantdiseaseresistance solid fermentation 第一章 引言 第一章 引言 1.微生物果胶酶研究概况 果胶酶是指可以或许催化果胶质分化的多种酶的总称。早在 1930年,果胶酶就 起头使用在生果加工和果酒酿造范畴。到了六十年代,因为对动物组织的化学性 质有了较深切的领会,果胶酶的使用范畴进一步拓展了。近年来,果胶酶在果汁 加工和纺织工业中的使用己经是不成或缺的了11[1跟着动物病理学研究的深切, 病原菌侵染动物的过程和机理越来越明白。研究表白,真菌果胶酶在病原菌侵染 动物组织的晚期阶段阐扬着主要感化[21。它能够降解动物细胞壁的果胶质,协助 病原菌在动物组织上定植;同时,它可以或许诱导动物发生一系列的防卫反映,包罗: 植保素堆集[3,41、木质化感化[[51、卵白酶抑止剂合成(61、坏死感化 (necrosis)[1、 乙烯合成[8l、病程相关卵白合成[91等。因而,将果胶酶使用于诱导动物防止病害 的前景也越来越开阔爽朗。 1.1果胶酶的感化模子、分类及性质 1.1.1果胶质的构成和性质[[101 果胶酶的感化底物— 果胶质普遍具有于高档动物中,是动物细胞间质和初 生细胞壁的主要组分,在动物的细胞组织中起着 “粘合”的感化1[(11。在分歧动物 及同种动物的分歧发展期,动物组织中果胶质的含量各别。在细胞壁中,果胶质 和纤维素及金属离子相连系,构成不溶于水的原果胶质。在成熟的果实和蔬菜中, 一部门果胶质呈消融形态而间接具有于细胞液中。1944年美国化学协会 (AmericanChemicalSociaty)给出如下定义:果胶质 (PecticSubstance)是 种 源于动物或从动物制备的复合胶体碳水化合物,其根基单位是半乳糖醛酸,而其 多聚物的珍基被甲醇部门酷化,或者部门或全数由一个或多个碱基所中和。 Whistle:和Smart指出,果胶质是由a-1,4-D一多聚半乳糖醛酸构成,而且具 有必然含量的L一阿拉伯聚糖和0-1,4-聚半乳糖支链。除D一半乳糖醛酸外, L-鼠李糖、L一阿拉伯糖、D一半乳糖、D一木糖和L一岩藻糖也己被分手到并研究了 其特征。还有文献报道了一些由这些杂糖形成的更为精细的布局。 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 果胶质布局化学的研究成果表白,果胶质的化学布局比力复杂,除了根基骨 架布局外,其他细微布局还小十分清晰。我们对果胶多糖分子作一总结如下:该 分子是由杂多糖构成,其根基骨架是a-1,4一糖营键毗连而成的聚半乳糖醛酸, 半乳糖醛酸狡基能够分歧程度地被甲酷化,C2,C3轻基少量地被乙酞化,在主 链之外,也可能具有L一阿拉伯聚糖和口一1,4-聚半乳糖支链,该分子内也可能存 在L-鼠李糖富集区以及少量的木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。 上式中,X为一OH或 一O-CH3 图1-1果胶分子布局 果胶质按其分子中D一半乳糖醛酸上的梭基酷化度分歧,可分为果胶、水溶 性果胶酸和果胶酸till。在果胶分子中,约有75%梭基为甲醇所酷化 其醋化程 度往往随来历和提取方式而异(图1-1)。甲醋含量低的果胶则称为水溶性果胶酸 (pectinicacid),JL乎不含甲Aa的果胶称为果胶酸 (pecticacid). 果胶质的分子量从几万到几十万不等,分子量大小受来历和提取方式的影 响。果胶溶液具有较高的旋光值。D一半乳糖醛酸的比旋光度[a1。20为+51.80。而 果胶多糖的平均比旋光度a〔]n2“为+2350。果胶多糖在水、二甲基亚矾、甲醛和 热甘油中是可溶的,而在大大都无机溶剂中是不溶的。果胶很主要的一个物理性 质是它能同糖或酸构成胶,食物工业恰是使用这一性质出产胶冻类食物。 酸水解果胶中醋键或糖营键受温度影响很大。在低温下酸趋势于水解醋键而 糖昔键水解甚少,在高温下则水解糖昔键较为敏捷。酸处置能降低非糖醛酸糖的 第一章 引言 量,例如,阿拉伯聚糖对酸很敏感。果胶的甲酷基团能够通过稀碱在低温下不变 地皂化而且无解聚发生。 1.1.2果胶酶的感化模子和分类 因为果胶质的化学布局很是复杂,可以或许催化其分化的果胶酶也是品种繁多。 果胶酶能够分成两大类:果胶解聚酶 (depolymerizingenzyme)和果胶酷酶 (pectinesterases),见表 1-1。果胶酷酶的感化是从果胶分子上移走甲氧基 (图 1-2),果胶解聚酶的感化是降解果胶糖昔键。果胶解聚酶又可分为两个类别:果 胶水解酶和果胶裂解酶。果胶水解酶的感化是水解果胶糖普键 (图1-3);果胶裂 解酶的感化是通过口消弭反映使糖昔键断裂,该酶攻击底物的糖营键在临近梭基 或酷化的梭基一边发生a消弭 (图1-4)0 甲沐M n炜0 -y +nC珠OH 图1-2果胶甲醋酶感化模子 上式中,X为 一O 时,底物为果胶酸盐;X为一O-CH、时,底物为果胶 图1-3果胶水解酶感化模子 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 、丰、、 本 ox off H0 0 0 ‘ X 、 、 岁 葬 、 ‘ . Ho 门 ﹄ , 、 ﹃ . l e s . 0 儿 r l 上式中,X为 -0 时,底物为果胶酸盐;X为一O-CH,时,底物为果胶。 图1-4果胶裂解酶感化模子1121 果胶解聚酶又有内切酶和外切酶之分,内切解聚酶是指该酶随机地堵截长 链分子内的糖昔键,而外切解聚酶是指从链的一端逐一堵截糖昔键。而且各类果 胶解聚酶对底物的选择又有不同,有的对酷化度高的果胶感化容易,有的对酷化 度底的果胶感化容易。总之,按感化类型来分,果胶解聚酶又可分为很多种,见 表1一la 别的,有些作者还将原果胶酶(profopeclinase)也归属为果胶酶,原果胶酶 的感化是从不溶性的原果胶释放出可溶性的果胶。因为原果胶酶也是很大的一类 酶的总称臼3一5〕‘,作者控制的文献无限,不在本文做更深切的综述。 1.1.3果胶酶的性质[10] 果胶酷酶 (EC3.1_1.11)次要来历于高档动物、真菌、某些酵母和细菌。 MacDonnell等人指出,果胶醋酶对果胶酸甲酩有较高的专注性,藻酸的甲酷就 不克不及为果胶醋酶降解,而各类动物及线酶对果胶乙醋的水解速度 是甲酷的6-8%。果胶酷酶对起感化底物聚合度有必然要求,当底物的聚合度 低于10时,果胶酷酶的水解速度随底物的链长削减而降低,当聚合度为3时, 水解速度降至零。 内切聚半乳糖醛酸酶 (EC5):随机水解聚半乳糖醛酸(盐)的1,4- 第一章 引六 a一糖昔键。该酶源于良多动物病原菌、腐生真菌、细菌和某些酵母。此外,该 酶也发生于高档动物,出格是在成熟的生果中。内切聚半乳糖醛酸酶对底物有一 定的专注性,其降解果胶的速度虽果胶的酷化度添加而降低。该酶不克不及水解二聚 体,以至不克不及水解三聚体。 表1-1果胶酶的分类[i1 A.果胶解聚酶 (depolymerizingenzymes) 1一果胶水解酶(hydrolyzingglyocsidiclinkages) a.聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonases)简称;PG (1)内切聚半乳糖醛酸酶 (end-PG) (ii)外切聚半乳糖醛酸酶 (exo-PG) b聚甲基半乳糖醛酸酶 (polymethylgalacturonases)简称:PMG (i)内切聚甲基半乳糖醛酸酶 (end-PMG) (1劝 外切聚甲基半乳糖醛酸酶 (exo-PMG) 2,果胶裂解酶 (cleavingglycosidiclinkages) a.聚半乳糖醛酸裂解酶 (polygalacturonatelyases)简称:PGL (i)内切聚半乳糖醛酸裂解酶 (end-PGL) (ii)外切聚半乳糖醛酸裂解酶 (exo一GL) b.聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 (polymethylgalacturonatelyases)简称:PMGL I)内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 (end-PMGL) ii)外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 (exo-PMGL) B.果胶酷酶 (pectinesterases)简称:PE 外切聚半乳糖醛酸酶:从一端起头,挨次水解聚半乳糖醛酸(盐)的 1,4一a- 糖背键。该酶来历于某些高档动物、真菌、细菌和良多虫豸的肠道。该酶更容易 感化高分子量的果胶酸盐(酷)。感化起点长短还原端,释放出半乳糖醛酸盐(酉旨) 单糖。寡聚的底物,以至二聚体也能被降解。 内切聚半乳糖醛酸裂解酶 (EC):随机裂解果胶酸的 1,4一a一糖普 键。一些动物软腐病菌、食物败北菌以及霉菌菌能发生endo-PGL。细菌endo-PGL 在解聚果胶酸时需Cat`,感化最适pH为6.8-9.0。对果胶酸感化时,若堵截1-3% 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 糖普键,其成果可使粘度降低50%.最终产品凡是是不饱和二半乳糖醛酸至八半 乳糖醛酸, 外切聚半乳糖醛酸裂解酶 (EC)从果胶酸的还原端起头,挨次裂解 聚半乳糖醛酸的 l,4一。一糖营键。该酶来历于微生物。多酶梭状芽抱杆菌 exo-PGL最适pH为8.5,C扩十对该酶具有激活感化。该酶可将聚半乳糖醛酸降解 为不饱和半乳糖醛酸。 内切果胶裂解酶 (EC0):随机裂解果胶的1,4-a一糖有键,产品 为带甲酷的寡聚糖。该酶的最适底物是高酷化度的果胶,而果胶酸盐、果胶酞服 和昔钱酞酷不克不及被酶感化。大部门果胶裂解酶能显著地被钙离子或其他离子激 活,激活感化同反映pH值和果胶的醋化度相关。该酶的活性随底物的聚合度增 力11而降低。 1.2微生物果胶酶的合成 1.2.1产果胶酶的菌种 文献报道的产果胶酶的菌种次要有两类:细菌和真菌。产果胶酶的细菌次要 有假单抱杆菌属 (Pseudomonas),黄单抱杆菌属 (Xanthomonas),欧文杆菌属 (Erwinia),芽抱杆菌属 (Bacillus),梭菌属 (Clostridium)。产果胶酶的真菌主 要有曲霉属 (Aspergillus),青霉属 (Penicillium),盾壳霉属 (Coniothyrium), 镰抱属 (Fusarium),克鲁维氏酵母 (Kluyveromyoes)等。据不完全统计,文献 报道的菌种有近百种[[101。较近期的文献还报道了一些颠末诱变或原生肢体融合技 术选育的果胶酶出产菌株,也取得了必然的进展D[S-r91。而贸易化果胶酶的出产主 如果用曲霉属和青霉属的菌种[[201黑曲霉是生物手艺范畴最主要的菌种之一,由 于其优良的平安性,在胞外酶和柠檬酸出产方面己无数十年汗青[[211。除了我们自 己的工作外,作者尚未发觉相关草酸青霉 (Penicilliumoxalicum)发酵出产果胶 酶的报道。 12.2果胶酶的微生物发酵出产 微生物果胶酶的合成需要在果胶质的诱导下发生,因而在果胶酶出产培育基 中必然要添加果胶质。晚期文献报道表白,非论是那种产果胶酶微生物,在培育 基中添加果胶或果胶酸都是提高产酶程度的无效法子。可是对于工业使用来说, 第 章 引言 添加果胶制剂出产果胶酶是不经济的,后来的文献报道了很多使用富含果胶质的 农产物烧毁物来出产果胶酶的方式[101。这使得果胶酶的贸易使用潜力大幅度增 加 果胶酶的发酵出产工艺有固态发酵和液态发酵 (深层发酵)两品种型。液态 发酵所采用的果胶质底物大都是分歧来历的果胶产物,如:Friedrich等人!22,231 用苹果果胶作底物,接种Aspergillusnige;深层发酵合功效胶酶;Jain等人D71分 别用分歧酷化度的苹果果胶和柑桔果胶作底物,接种Penicilliumoccitanis进行 液态发酵合功效胶酶。而固态发酵能够采用农业烧毁物或农产物加工副产物来作 碳源和果胶酶诱导物,如:Hours等人[[241用果汁厂的苹果渣作原料,接种 Aspergillusfoetidu:固态发酵出产果胶酶,取得了对劲的结果;Cavalitto等人[251 用9T皮作底物进行固态发酵出产果胶酶:我们尝试室用甜菜粕作碳源,接种溜曲 酶827进行固态发酵,出产果胶酶和微生物卵白饲料也取得了成功!10,261 显而易见,固态发酵的原料成本劣势较着。不只如斯,固态发酵相对于液态 发酵而言还具有诸多长处,Solis-Pereyra等人[27〕将其归纳为:(1)需水量少;(2) 无菌情况要求不严酷;(3)发酵底物浓度大;(4)产品浓度高。徐福建[2a]也归 纳了固态发酵的特点:(1)发酵成本低,原料廉价,能够间接操纵工农业残渣 纤〔 维质原料等可再素性资本)等底物:(2)模仿天然发展情况,使微生物连结与自 然界类似的发展形态;(3)无 “废水、废渣、废气”等三废排放;(4)产物后处 理简单,易于储藏和运输。 1.3味精废水的分析管理 我国是味精出产大国,味精行业是我国发酵工业的次要构成部门之一。跟着 味精出产的不竭成长,该行业对四周情况的污染也在不竭加剧。味精废水是味精 出产工艺的最次要污染物之一,处置难度大,处置成本高。 1.3.1味精废水的来历和成分[291 目前国内味精厂所发生的味精废水中,按照发生的分歧的阶段分为等电后母 液、离交后尾液和气浮除去菌体卵白后的排放液,三种废水的关系如图1-5所示· 现实上味精厂目前所排放的废液次要以气浮后废水为主,个体没有建气浮处 理池的工场一次要以离交尾液为主,间接排放等电后母液的工场就更少了。有的工 厂还建有膜浓缩处置厂,对气浮后废水进行浓缩,经超滤、纳滤后,透过液到好 果胶酶发酵合成及其诱导动物杭病性研究 氧污泥处置池处置,对此类工场还要考虑膜浓缩的浓缩液问题。一般味精厂最迫 切的问题是处置气浮或离交后的废液,其污染负荷和排放量如表1-2所示。 竹电后母液 离交尾液 冬气浮后废液 谷氨酸 菌体卵白 图1-5味精废水的排放挨次 表1-2高浓度味精废水的污染负荷和排放量 污染目标 含量 (PPM) 污染目标 含量 (PP-) PH 1.5-3.2 NH3-N 5000-7000 CODer 30000-70000 SOl 8000-20000 BODS 20000一2000 谷氨酸 0.2-0.4(%) SS 12000-20000 菌体 (%) 1.0(%) 排放量 15-20(TIT味精) 1.3.2味精废水的处置方式[[301 味精废水的处置一般是先用物理和化学方式从废水中提取谷氨酸菌体单细 胞卵白 ((SCP),通过度离菌体能够去除30%摆布的COD。目前所采用方式有: 高速离心、加热沉淀、絮凝沉降、微孔膜过滤等。 理化法处置后的味精废水再用生物方式处置。生物处置方式次要有:饲料酵 母法、厌氧生物处置法、好氧生物处置法、藻菌共生处置法等。按照GB8976-88 尺度,轻工业部保举味精废水管理方式为: (a)一级水域废水三级管理工艺流程: 废水逐个)饲料酵母逐个务厌氧逐个卜好氧逐个卡排放 (b)二级水域废水二级管理工艺流程: 废水 逐个》厌氧 逐个4.好氧 我们尝试室操纵味精废水培育苏云金芽袍杆菌取得了可喜的功效[311。在木文 的第止章,作者提出了操纵味精废水和农产物加工废渣固态发酵出产果胶酶,取 得了对劲的成果。 第一章 引 占 1.4果胶酶的分手纯化方式 为了细致领会和深切研究各类果胶酶的性质和功能,必需先将其分手纯化。 在分手果胶酶时 保守的酶学万法都能够自创 现有的酶的纯化方式都是以酶与 杂卵白在理化性质、不变性上的差别以及酶的生物特征为根据而成立起来的[32] 包罗: (1)按照消融度分歧,有盐析法、无机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉 淀法、等电点沉淀法、液一液分手法以及结晶法等。 (2)按照分子大小的不同,有凝胶过滤 (层析)法、超滤法及超离心法等。 (3)按照电学、解离性质,有吸附层析法、离子互换层析法、电泳法以及 聚焦层析法等。 (4)基于酶和底物、辅助因子以及抑止剂间具有专注的亲和感化特点而建 立的各类亲和分手方式。 (5)操纵不变性差别而成立的选择性热变性法、酸碱变性法和概况变性法。 (6)高效液相色谱法 (HPLC)是各类层析手艺使用上的一个成长新阶段, 它以这些层析的道理为根本,可是具有更高的效率、更高的分辩与更快的速度。 它已成为卵白质分手、纯化的无力东西。 因为微生物发酵所获得的粗酶液成分比力复杂,因而果胶酶的分手纯化要综 合考虑各类方式的特点,结合使用几种方式才能获得对劲的结果。例如:Ishii和 Yokotsuka[33]从Aspergillusjaponicu:的发酵产品中纯化endo-PG结合使用了乙醇 沉淀、硫酸钱分级、SE-Sephadex柱层析和SephadexG-100凝胶过滤等纯化方式。 Keste:和Visser[34]从贸易果胶酶制剂 (自黑曲霉)平分离纯化出5种endo-PG 和1种exo-PG,结合使用了亲和吸附、SephadexG-50柱层析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、DEAE-Sepharose快流速柱层析以及SephacrylS-200柱层析等。 Gadre等[35}从嗜冷真菌Mucor加vu:的发酵液中纯化出3种endo-PG,他们先用 截留分子量为10000的超滤膜净化、浓缩粗酶液,在用CM-SepharoseCL6B离 子互换剂在快速层析柱((PharmaciaFPLCsystem)长进行分手纯化。在SDS 电泳上获得3种均一的endo-PGo 相关果胶酶分手纯化的文献较多[36,37],总的来看,一般先用沉淀法或超滤法 将租酶液中的杂质大部门去除,减小后续分手纯化步调的负荷:再用柱层析的方 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 法如 离子互换、凝胶过滤等进行较详尽的分手纯化;最初用电泳检测酶的纯度 和分子量 15果胶酶的使用 1.51使用于果蔬汁出产和果酒酿造 使用于果汁出产和果酒酿造的果胶酶凡是是由真菌 (特别是黑曲霉)发生的 酸性果胶酶。在果蔬汁出产万面,果胶酶的用处次要有:(1)提高榨汁出汁率和 澄清果汁:(2)制备混浊果蔬汁;(3)制备悬浮单细胞产物。在果酒酿造方面, 果胶酶也次要用于果汁处置和澄清川。 常见的澄清果汁有苹果汁、梨汁、葡萄汁、草毒汁等。制备澄清果汁时,一 般要在生果破裂后插手果胶酶,降解组织中的果胶质,以便在榨汁时有较高的出 i{率和容易过滤;在榨汁后再插手果胶酶使果汁澄清并有较好的不变性。H前用 于榨汁的果胶酶一般都采用复合酶,此中除果胶酶外,还有必然比例的纤维素酶 和半纤维素酶,该复合酶的商品名称也称作果浆酶。有文献报道,用复合果胶酶 在苹果榨汁时能够使出汁率接近100%1311。在未成熟的苹果中含有必然量的淀粉, 用其榨汁时,还需要添加必然量淀粉酶才能获得澄清的果汁。Schols等人[391发觉 一种果胶酶,称为鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase),它的感化是软化 苹果组织。在果酒酿造过程中,用果胶酶处置后的果汁作原料能使发酵过程容易 节制,果酒的色泽和风味好。 常见的混浊果蔬汁有橙汁、番茄汁、柠檬汁、菠萝汁、芒果汁等。在混浊果 蔬汁出产过程中,插手果胶酶能使混浊度连结不变。与澄清汁分歧的是制备混浊 汁应尽量削减果胶醋酶的活性,并且要节制酶的感化时间。该处置过程无限制地 分化果胶,使果蔬汁的粘度有必然的降低,但不粉碎不溶性的果胶以连结混浊度 的不变性。 单细胞产物是由原动物组织转化而成的完整细胞的悬浮液,能够作为果肉果 汁、乳成品以及婴儿食物的根基原料,还能够作为各类生物手艺使用方面的原生 质体 该过程包罗浸软动物组织、液化和糖化生物质、分手原生质体等!]。‘ 1.5.2使用于纤维作物的脱胶 使用于纤维作物沤制和脱胶的果胶酶大部门是细菌来历的碱性果胶酶,特别 第一章 引含 是芽他杆菌属的菌种 (Bacillussp.)。这些纤维作物包罗:黄麻、亚麻、、 兰麻、剑麻、洋麻以及椰子壳等14[01沤麻有雨露沤麻和厌氧沤麻两种方式。雨露 沤麻是将动物秸秆在地面上铺一薄层,使线周时间, 该方式受天气的影响较大,周期较长。厌氧沤麻是将秸秆捆成束,浸泡在水坑或 水泥池子里进行沤制,也能够浸泡在流动的活水中。在池子里沤制会很快地耗损 掉水中的消融氧,厌氧菌群大量繁衍。此中,梭菌属(Clostridia)起次要感化,尤 其是Clostridiumbutyricum和Cl.Felsineum。在沤麻和椰子壳沤制过程中还分手 到Bacillus,Pseudomonas和Micrococcussp.等微生物[]。‘这些微生物排泄出大 量的果胶酶和其他多糖降解酶,使果胶、半纤维素、蜡质等分化,释放出纤维。 1.5.3其他方面的使用 果胶酶在各个分歧范畴使用的报道还有:含果胶废水的处置、造纸、榨油、 咖啡和茶的发酵、木材防腐、反当动物的饲料添加剂、桔子脱囊衣等。据估量, 在1995年工业酶制剂发卖额为10亿美元,此中7500万为果胶酶D1。近来,Rogstad 等人141岭果胶酶使用于各类动物DNA的提取过程中,取得了可喜的进展。动物 病理学研究认为:真菌的内切聚半乳糖醛酸酶 (Endo-PGs)在动物组织中至多具 有两种功能,第一,它能够粉碎动物细胞壁布局,使病原真菌定植于动物组织并 为其供给养分。第二,它能够激策动物的防卫反映,由于它分化动物细胞壁所产 生的寡聚糖是激策动物防卫反映的信号。因而,将其作为诱导动物抗病的农药也 是很有潜力的。 2.动物诱导抗病性研究进展 动物病害不单严峻影响农作物的产量和质量,它还间接无害于人、畜的健康。 因为病害的严峻风险,汗青上曾发生过两次严峻的大饥懂,1845年在爱尔兰因 马铃薯发生晚疫病而形成数十万人饥饿灭亡和大量移民;1943年在孟加拉因水 稻发生胡麻斑病饿死人数竟跨越200万人。还有少数传染病害的农产物,食用后 可惹起中毒,如我国长江流域遍及发生的麦类赤霉病的病麦粒,食用后可惹起腹 痛、吐逆、下泻等病症1[421 日前动物病害的防治仍以化学防治为主。化学防治动物病害能够及时、快速 地杀火动物病原生物,从而达到农作物高产、稳产的目标。可是它很容易对情况 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 和食物形成的污染,化学农药的公害性已被人们遍及注重。跟着化学杀菌剂的长 期利用,病原微生物呈现了很多抗药性菌系,如青霉菌刘一联苯、丝核菌对五氯硝 基苯、火疫细菌对链霉素和一些尾抱属、镰刀菌属、白粉菌、曲霉、青霉、丝黑 穗菌对一种或多种内接收杀菌剂呈现抗性菌系,还有水稻稻瘟病呈现了对春雷霉 素、异稻瘟净、克瘟散的抗性菌系,柑桔青霉菌和丝霉菌、苹果黑星病菌、西瓜 枯萎病菌以及蔬菜灰霉病菌等都呈现了苯来特、多菌灵等的抗性菌系。病原菌抗 药性菌系的不竭呈现也对化学防止动物病害的方式提出了挑战。 跟着动物病理学研究的深切,动物和病原微生物之间的互作关系也越来越清 楚。动物在进化过程中,本身己经构成了一套抗病机制,病原微生物的侵染可诱 发寄主抗病机制的表达 (即防卫反映),限制病原微生物的过量繁衍,避免寄主 动物绝种。因而,我们能够按照这一机制,在非病原菌侵染的环境下,诱导动物 的防卫反映,加强抗病性,防止病害的发生,限制病害的成长。 2.1动物的诱导抗病物质— 激发子 ((elicitors) 激发子是一类能诱导寄主动物发生防卫反映的特殊化合物。当病原物与寄主 动物接触时,因为激发子的感化惹起寄主动物发生很多生化变化。这些生化变化 能够导致动物多种防卫反映的发生,从而限制病害的成长[4s[。晚期的文献用激发 子(elicitor)这一术语来暗示可以或许惹起动物细胞合成并堆集植保素(phytoalexins, 抗微生物的化合物)的分子和其他刺激物4[4[,可是后来的研究发觉这些物质同样 可以或许惹起动物细胞或组织其他防卫反映的发生[45-46],此刻这一术语被遍及用于那 些可以或许激策动物任何防卫机制的分子[[47-09]。这些防卫机制包罗:抗微生物的植保 素的合成和堆集,攻击病原物概况多聚物的糖基水解酶的发生,抑止病原物降解 酶的卵白抑止物的合成,因为脱服质、富含轻脯氨酸糖卵白或木质素堆积而对植 物细胞壁的润色感化等。 2.1飞生物源激发子 该类激发子来历于病原生物、其它微生物和寄主动物或由寄主与病原物互作 后发生。由病原生物或其它微生物发生的激发子称外源激发子,由动物本身发生 的激发子称内源激发子。外源激发子包罗真菌的a-葡聚糖、糖卵白、脂类物质和 其它细胞壁组分,细菌胞壁布局组分中的脂多糖和卵白质,病毒的外壳卵白,线 虫口针和头部的糖卵白组分等。内源激发子次要是动物细胞壁组分中的寡糖物 第一章 引言 质,如寡聚半乳糖醛酸和木聚糖片段等。寄主与病原物互作后发生的激发子次要 是由互作过程中酶对寄主和病原物细胞组分润色后发生的,如动物中的几丁质酶 和0-葡聚糖酶降解真菌细胞壁组分后释放的脱乙酞儿丁质和葡糖普片段。这种由 寄主与病原物互作后发生的激发子又称为次生激发子,而由病原微生物和动物ft- 接发生的激发子又称原发激发子4[[31 (I)复合糖类激发子 早在1975年 Anderson-Prouty和Albersheim[50]起首报道了从Phytophthora megasperntafsp.Soja。菌丝平分离出的葡聚糖可以或许诱导寄主的抗病反映。后来证 实了该糖的最小活性部门是一种六聚葡糖昔 (hexaglucoside),而七聚和八聚葡 糖昔具有更高的活性[[s1-szloCheong等人[[53】通过对合成的一系列寡聚葡糖普的激 发子活性测定,确定了最高活性的焦点单位。各类寡聚糖在诱导动物防卫反映方 面的综述己有多篇报道[[54-571。在从其它微生物菌体中提取的葡聚糖粗提物也具有 激发子活性,如从白粉病菌(Erysiphegraminisfsp.hordei)中提取的葡聚糖[5$1 葡聚糖酶具有于动物细胞壁中[59],它可以或许降解病原真菌菌丝体的葡聚糖,发生一 系列的分歧分子量的寡聚糖,小分子量的片段容易透过动物表皮而被接收,诱发 动物防卫反映。宁君和孔繁柞6[0-61}研究小组用无机合成的方式实现了该类激发子 的大规模制备。 几丁质 (chitin)和壳聚糖 (ehltosan)及其寡聚糖片段也可以或许诱导动物的抗 病性。儿丁质是很多真菌细胞壁的布局成分,壳聚糖是几丁质脱乙酞基后的产品。 壳聚糖的抗真菌活性和激发子活性都要优于几丁质,而壳聚糖的七聚寡糖诱导豌 豆素的合成和抑止病原菌 (Fusariumsolani)的活性最高[621。六聚PJA聚的壳聚 糖可以或许减轻土豆叶子被estans的侵染,防效可达70%.Hadwiger等人[[631用 合成的壳聚糖的寡糖查验了聚合度与诱导豌豆素堆集和抑止真菌 (Fsolani)生 长的关系,成果表白,八聚寡糖活性最高。ElGhaouth等人[[64]报道了操纵壳聚糖 节制由Pythiumaphanidermatui,惹起的黄瓜根腐病。蒋挺大[65]引见了壳聚糖用 于多种作物的种子处置剂,可推进作物发展,提高抗病能力,提高产量。儿丁质 和壳聚糖的寡聚糖被认为是在寄主与病原物互作中因为动物酶的感化从真菌细 胞壁释放出来的。几丁质酶和壳聚糖酶属于一类病程相关卵白,由病菌侵染或激 发子诱导发生。它们除了在释放激发子中起感化外,还有间接抑止真菌发展的作 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 用。 寡聚半乳糖醛酸属于内源激发子,聚合度 (DP)较大的寡糖 (DP10),具 有诱导植保素堆集的激发子活性,而聚合度较小的寡糖诱导卵白酶抑止剂合成的 活性较高。在发觉寡聚半乳糖醛酸有激发子活性之前,是先发觉了果胶酶具有诱 导动物抗病性的激发子活性,如:West等人[66-671用分手自Phizopusstolon乒;真 菌培育物的内切聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)处置蓖麻幼苗,诱导蓖麻素(casbene, 一种抗真菌剂)的合成。他们接下来的研究发觉,用endo-PG处置蓖麻组织能得 到热不变的激发子,认为该激发子是动物细胞壁的果胶片段。Davis等人4[[]用 Erwiniacarotovora的内切聚半乳糖醛酸裂解酶 (endo-PGL)诱导大豆的植保素 堆集,认为该酶的诱导感化是通过降解动物细胞壁,释放出细胞壁的果胶片段来 实现的。Cervone等人[71纯化了商品果胶酶 (由黑曲霉发生),别离用纯化的 endo-PG和寡聚半乳糖醛酸处置BI豆 (lrgnaunguiculataWalp.)的豆荚,都诱导 了坏死反映的发生。Boudart等人[[68]用聚合度为10-15的寡聚半乳糖醛酸处置大 豆组织切片(beancuttings)诱导了PR卵白的添加,而他们之前的研究工作也是 先用endo-PG诱导了这种抗性反映。C6t和‘Hahn[54]综述了各类聚合度的寡聚半 乳糖醛酸的激发子活性。 (2)卵白类激发子 从病原生物和其它微生物中曾经发觉很多卵白质或糖卵白具有激发子活性, 见表1-3. 表1-3一些卵白类激发子的特征4[[31 激发子 来历 靶动物 反映 AVR9(28个氨基酸的肤) Cladosporium户lvum 番茄 HR,PRs AVR4(106个氨基酸) Cladosporiumfulvum 番茄 HR,PRs 隐地卵白和其它激发子 Phytophthoracryptogea 烟草 HR,SAR,乙烯,植保素 糖肤 酵母 番茄 苯丙氨酸解氨酶 内切木聚糖酶 P妙tophthoraparasitica 烟草 植保素 内切聚半乳糖醛酸酶 几种真菌 多种动物 植保素 外壳卵白 TMV 烟草 HR 第一章 引言 该类激发子中研究最多的是内切果胶酶类激发子,前面曾经列举了一些文献 的研究环境,总体来看,不管是病原菌的内切果胶酶仍是其它微生物的内切果胶 酶,不管是内切水解酶仍是内切裂解酶[691,都具有激发子活性。进一步的研究发 现,果胶酶的激发子活性是通过降解动物组织中果胶质发生寡聚半乳糖醛酸,这 些寡聚糖作为内源激发子诱导动物防卫反映的发生。寡聚半乳糖醛酸必需连结- 定的聚合度才有激发子活性,若是被果胶酶分化的太小就会得到活性。 Albersheim等人[[70]的研究发觉,动物细胞壁中具有一种可以或许抑止动物病原菌聚半 乳糖醛酸酶的活性,称之为聚半乳糖醛酸酶抑止卵白((PGIP)。他们认为PGIP 与聚半乳糖醛酸酶的关系可能是动物将病原菌的毒性因子 ((PG)转化为防卫激 发子的机制[7}1 Lyon等人[72-751颁发了一系列文章研究酵母细胞壁提取物诱导动物的抗病 性,可是没有报道该类提取物中具有激发子活性的化合物的布局。他们认为该方 法适用价值较高,而且提出了操纵激发子防治动物病害的新策略。Basse等人[76-771 报道了从酵母中提取的部门纯化的糖肤具有激发子活性,能够诱导番茄细胞中乙 烯的合成。Grosskopf等人[781用酵母糖肤处置番茄的悬浮培育细胞,诱导了乙烯 的生物合成、苯丙氨酸解氨酶的添加以及脐服质的构成。大雄疫霉大豆专化型培 养滤液平分离出一种糖卵白能诱导欧芹细胞和原生质体发生香豆素。对该卵白N 端毗连的葡糖昔部门用化学或酶学方式去除后不影响激发子活性。如用卵白酶进 行处置,其活性则会丧失殆尽。 隐地疫霉 (P.cryptogea)发生一种1.0X100u卵白(隐地卵白)是一种全蛋 白激发子,以低浓度处置烟草能够诱导坏死反映并发生对晚疫病的获得抗性。同 时发生的防卫相关物质有乙烯、倍半菇烯植保素和病程相关卵白。其它疫霉,如 恶疫霉 (P.cactorum)、辣椒疫霉 (Pcapsici).樟疫霉 (P.cinnamomi)、柑橘褐 腐疫霉 (P.citrophthora)、治病疫霉 (Pinfestans)、大雄疫霉 (Pmegasperma) 和寄生疫霉 (P.parasitica)等都发生类似的胞外卵白,并且均表示对烟草的激发 子活性。这些卵白构成一族特殊的激发子类群被称为激发素 (elicitin)o AVR激发子是一类由真菌发生的卵白类激发子,可是只要在动物与病原物 彼此感化过程中发生,而真菌的培育物中检测不到。它们可以或许诱导动物的过敏反 应和病程相关卵白的变化。 果胶酶发醉合成及其诱导动物抗病性研究 (3)其它生物源无机化合物 水杨酸被认为是内源激发子,它能够诱导病程相关卵白(pathogenesis-related proteins,PR)和一些系统获得抗性 (systemicacquiredresistance,SAR)化合物的 合成[79],而且可以或许诱导PGIP的添加〔I.Malamy和Klessig8(11综述了水杨酸及其 衍生物乙酞基水杨酸 (aspirin)在动物防卫反映方面的感化。水杨酸可以或许诱导多 种动物对病毒、真菌、细菌等多种病害的抗性,己经报道的动物有:烟草、大豆、 番茄、马铃薯、更豆、水稻、黄瓜、芦笋和大麦等[82-83]。可是将其使用与大田作 物抗病的报道并不多见。 很多种不饱和脂肪酸可以或许诱导马铃薯的系统抗性防止治病疫霉的侵染,它们 包罗花生四烯酸 (arachidonicacid)、二十碳五烯酸 (eicosapentaenoicacid)、亚 油酸 (linoleicacid)、亚麻酸 (linolenicacid)、油酸 (oleicacid)等[841 茉莉酸和茉莉酸甲R9 (jasmonicacidandmethyljasmonate)作为一种天然的 动物发展调理剂在很多动物长进行了普遍的研究8[[5]。用茉莉酸或其甲醋处置温室 中培育的马铃薯和番茄,用62.5m/gjli 的浓度处置能够诱导对治病疫霉的局部抗 性,而用Img/ml的浓度处置能够诱导系统抗性8{6]。可是该物质在大田的使用未 见报道。 氨基酸诱导动物抗病性也有报道,Cohen等人[87.88]报道了用DL-2-氨基一n一丁 酸诱导番茄抗治病疫霉,不管是在接种病原菌之前利用,仍是在接种后利用都有 较高的防治结果。该氨基酸用于防治烟草的病害(Peronosporatabacina)也有较 好的结果。 乙烯是一种动物发展调理剂,也可以或许诱导动物的抗病性。如:用乙烯利处置 烟草和番茄,可以或许诱导PR卵白的添加t89-90]。乙烯也可以或许诱导水稻尽葡聚糖酶的 添加[911 2.1.2非生物源激发子 磷酸的钾盐和钠盐 (如:K3PO4,KzHP04,Na2HP04,Na3PO4等)具有诱 导动物抗病性的激发子活性,具有必然的有适用价值。例如:将该盐的水溶液喷 洒到黄瓜叶子上,能够诱导其对炭疽病(Colletotrichumlagenarium)的系统抗性。 这种诱导抗性与过氧化物酶和几丁质酶活性添加相关(921。在玉米叶面喷施磷酸盐 也能够诱导其抗病害(Pucciniasorghi)9[3]0 第一章 引言 紫外线也能够诱导动物堆集植保素,可是容易惹起组织毁伤A[9)能够通过调 节辐射剂量,来达到既不损坏动物组织又能诱导动物抗病性的目标[94] 其它一些非生物源激发子还有重金属离子、概况活性剂、多价阴离子、抗代 谢物质以及一些人工合成的化合物。非生物激发子的感化被认为是刺冲动物细胞 释放内源生物激发子的成果。 2.2动物诱导抗病性的分子机制 2.2.1识别和接管激发子刺激信号的受体 “识别”在动物和它们的病原物彼此感化过程中饰演着焦点的脚色。激发子 是一类典型的信号分子,在动物和病原物之间彼此互换消息过程中起着很是主要 的感化。动物防卫机制的发生是通过动物细胞中可以或许接管特殊激发子刺激信号的 位点来实现的,动物细胞上 (中)可以或许识别和接管激发子刺激信号的特殊组分称 为受体。 Hahn4[9】综述了多种微生物激发子的受体研究环境,认为激发子的识别次要 是通过动物细胞概况一种特殊的连系卵白。例如:他们操纵几种概况活性剂从大 豆根部细胞膜消融出葡聚糖激发子的连系卵白,而且证明这种连系卵白对七聚a- 葡糖昔具有特殊的亲和性。用辐射性标识表记标帜的几丁质寡糖处置水稻悬浮细胞,发觉 高亲和性连系位点在细胞膜上。番茄细胞膜上也同样发觉该位点,并发觉连系过 程是可逆的。用卵白酶处置动物细胞膜,则寡糖与细胞膜连系能力消逝,证明这 种连系位点的成分属卵白质类。寡聚半乳糖醛酸和果胶片段的连系卵白也从马铃 薯原生质体膜上分手出来并克隆了其相关基因[95] 其它的糖卵白或糖肤类激发子以及肤类激发子的连系卵白也被发觉,这些结 合卵白与激发子的连系具有可逆性、可饱和性和高亲和性等特点,具备典型的配 基与受体的部门特征。后来的研究曾经纯化了多种激发子的连系卵白,并描述了 其性质[[96-99]。可是它们在参与动物细胞对激发子的刺激发生反映的信号传导路子 的机制,目前还不完全清晰。 2.2.2激发子诱导的信号传导路子 大量研究表白,寄主动物对病原物信号的接管和传导过程与动物寄主对病原 物信号的接管和传送过程根基类似,都需要第二信使和卵白磷酸化的参与。其过 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 传布的挥发性农药污染范畴更广。农药的污染不只间接风险人们的身体健康,而 fl.t曾加了生态情况的承担,对农业的可持续成长发生不成低估的负面影响。 我国是世界蔬菜、生果品种最多,种植而积最大的国度,蔬菜、生果已成为 我国农产物中出口值大、效益很高的产物。但因为进口国对其农药残留目标节制 卜分苛刻,大大限制了我国农产物的出口。跟着我国人民糊口程度的不竭提高, 食用无公害农副产物、拒绝农药残留超标的农副产物己成为国人共识。2001年, 我国己插手世贸组织,虽然准绳上拆除了我国农产物进入世界自在市场的壁垒, 但具体的 “绿色壁垒”却在加高,而无效应对绿色壁垒的计谋之一是成长无公害 的生物农药,这是我们当前面对的机缘与挑战。 动物诱导抗病性研究进展给我们在动物病害分析防治的理论和方式上提出 了新思绪。本文将以果胶酶类动物诱导抗病激发子的制备方式及其诱导动物抗病 性为主线,展开微生物激发子的研究工作。总体研究思绪如下: (1)因为我们尝试室对微生物果胶酶的发酵制备己有必然的研究根本,而 且相关果胶酶类激发子的文献报道较多,因而我们将查验该类激发子对动物诱导 抗病的结果,并研究其利用方式、合用性和诱导抗病机理。 (2)果胶在酸水解或内切果胶酶的感化下能够释放出寡聚半乳糖醛酸片段, 该类寡聚糖也是一类动物诱导抗病激发子,并且其具有激发子活性的片段聚合度 范畴较宽,因而其制备方式不会太繁琐,我们也将查验其对动物诱导抗病的结果。 (3)其它微生物来历的激发子也有很多报道,我们也将查验分歧来历的微 生物细胞提取物和代谢产品的激发子活性。比力和评价各类激发子的使用价值。 (4)果胶酶作为一种工业酶制剂己无数十年的使用汗青,因而对其制备方 法的研究也具有现实意义,我们将进行果胶酶出产菌种的选育,果胶酶合成发酵 前提优化,工业化出产的工艺设想等研究工作,降低其出产成本。 (5)微生物发酵所得果胶酶粗提物是一个很是复杂的夹杂系统,除了各类 果胶酶及其同功酶外,还有纤维素酶、半纤维素酶的复合酶以及大量杂质。因而, 在果胶酶的使用中,所表示出来的性质是多种要素感化的配合成果,在研究其诱 导动物抗病性时,有需要对其次要成分进行纯化。我们将对微生物发酵所得果胶 酶粗提物进行分手纯化,并研究各类纯化产品的生化性质和激发子活性。 第二章微生物发酵合功效胶酶 第二章 微生物发酵合功效胶酶 1.媒介 果胶酶最后是由MacDonnell从桔子里提取获得的。之后,关于果胶酶具有 丁其他种生果和动物中的研究极大地丰硕了动物心理学学问。但从使用的意义上 讲,动物材料提取果胶酶是不现实的。微生物果胶酶的发觉,使人们终究实现了 果胶酶的工业化出产。跟着近代生物化学理论学问的成长和生物化工手艺的进 步,以果胶酶产质量量和出产成本为标记的贸易合作越来越激烈,为此,良多研 究J_作者在出产菌种挖掘、酶合成调控以及生化工程方面展开了对果胶酶合成的 深切研究pol 在菌种方面的工作,次要是对旧菌种的革新和新菌种的挖掘。包罗遗传工 程手段建立的菌种在内,文献报道的 (不完全统计)产果胶酶菌种有近百种”0]。 虽然真正用于工业出产的仅限于黑曲酶等少数菌种。然而这并不影响人们对挖掘 新的高产菌株的乐趣。本章工作报道的草酸青霉BZH-2002,就是一株还未见报 道的高产果胶酶菌株。 除了菌种固有的遗传要素外,酶的产量凹凸同培育前提亲近相关,通过对 培育前提的优化能够无效提高果胶酶的产量。本文研究了黑曲酶PE1650和草酸 青霉BZH-2002合功效胶酶的培育前提,发觉分歧菌种的培育前提具有较大差别。 另一方面,工艺路线的选择对酶的合成也很主要。凡是果胶酶的制备或出产可采 用液态发酵和固态发酵两种体例,工艺路线的选择需视菌种、原料以及酶的分手 难以程度等要素而定。 固态发酵工艺过程简单、投资低、能耗少正越来越遭到人们的注重[[102-1051 本文按照甜菜渣原料以及筛选出的黑曲酶PE-1650和草酸青霉BZH-2002的特 点,it化了固态发酵制备果胶酶的培育前提和培育及配方,取得了对劲的成果。 本文还初步测验考试了以液态发酵体例制备果胶酶,成果表白,黑曲酶PE-1650和草 酸青霉BZH-2002液态发酵的果胶酶产率都与固态发酵相差较大。 本文还调查了操纵味精废水作为氮源和水分,进行果胶酶发酵试验,取得 了对劲的成果。该方式为作者初次提出。 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 2 . 材料和方式 2 1 次要仪器、试剂和原料 21A 次要仪器设备 MJ-II型霉菌培育箱 (BluePard,上海一恒科技无限公司); 303-3A型数显隔水式培育箱 (南通科学仪器厂); XSZ-H型和XDS-1B型光学显微及成像系统 (重庆光学仪器厂); 80-2B型低速离心计心情 (上海安亭科学仪器厂): HZ-9201K型台式恒温振荡器 (太仓市科教仪器厂); 81-2型恒温磁力搅拌器 (上海司乐仪器厂); 752C型紫外可见分光光度计 (上海第三阐发仪器厂); CJT型干净工作台 (北京昌平长城空气净化设备工程公司)。 2.1.2次要试剂 果胶 (来自柑橘,半乳糖醛酸79%,甲氧基8%,Sigma公司); 果胶 (来自柑橘,半乳糖醛酸85%,甲氧基9.5%,Sigma公司); 酷化果胶(来自柑橘,酷化度89%,半乳糖醛酸82.8%,甲氧基11.8%,Sigma); 半乳糖醛酸 S〔igma公司); 梭甲基纤维素 (上海化学试剂采购站进口分装); 其他试剂均阐发纯或生化试剂。(略) 2.1.3次要发酵原料 甜菜渣 (东北某糖厂); 葵花盘 (油葵和出产葵花子的葵花盘,产地:河北); 生果废渣 (市场采办生果,榨汁后的废渣); 味精废水 (山东威海味精厂气浮处置后的味精废水); 无机xn均为国产阐发纯试剂。(略) 2.2阐发方式 2.2.1AJDA法测定内切果胶酶活性[10] (1)道理:果胶物质在果胶内切酶的感化下糖链断裂,糖链断裂的程度同 第二章微生物发酵合功效胶酶 酶活性成反比。通过按时插手异丙醇察看反映液沉淀消逝的鸿沟点 (即脱胶终 点),以脱胶时间长短评价酶活性。 (2)试剂:1%碘液,以少量高浓度的碘化钾溶液消融碘,然后用蒸馏水稀 释使碘和碘化钾最终浓度都是1%00.05mol/1柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液,先 别离配制。05mold柠檬酸溶液和柠檬酸三钠溶液,再按照分歧比例夹杂成所需 pH值的缓冲溶液。1%果胶溶液,用上述稀释10倍的柠檬酸缓冲溶液配制,在 搅拌环境下煮沸巧分钟,使果胶充实消融。 (3)测定方式:取3ml当天配制的果胶溶液置于o25X200mm的试管中, 插手合适pH的0.05mol/1柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液8ml,将试管置于40℃恒 温水浴热均衡5min,插手1ml事先稀释到必然浓度的酶液,并当即起头计时, 反映3分钟后取样1ml放入小试管,当即插手2滴1%碘液,摇匀,再插手2ml 异丙纯,动弹试管 (不克不及摇动),察看沉淀能否消逝,精确记实脱胶时间。 (4)酶活性定义:在上述操作前提下,30min使1mg果胶完全脱胶所需的 酶量为一个活力单元。 2.2.2还原糖法测定聚半乳糖醛酸酶活性[[101 (1)道理:聚半乳糖醛酸在聚半乳糖醛酸酶的感化下糖营键断裂并释放出 还原基团,3,5一二硝基水杨酸与还原基团反映后被还原成棕红色的氨基化合物。 在尝试前提下,还原基团的生成量和反映液的颜色呈反比关系,以次来评价该酶 的活性。 (2)由果胶制备聚半乳糖醛酸:称取5g果胶,溶于0.1M的NaOH溶液 中,放置1小时,然后用1M的盐酸溶液调理pH至2.5,获得白色凝胶状果胶 酸沉淀。减压抽滤沉淀,并用无水乙醇洗涤,干燥,制得果胶酸。 (3)DNS试剂配制:参照文献1【061的方式。 (4)测定方式:精确称取聚半乳糖醛酸配制成浓度为0.5-5.0wmol/ml的 溶液做尺度曲线。将聚半乳糖醛酸消融在。01mol/1,pH4.2的柠檬酸/柠檬酸三 钠缓冲溶液中制成。.25%的溶液。取1ml该溶液,加恰当稀释的酶液1ml,在 40℃恒温水浴中反映15min,插手DNS试剂1.5ml,混匀,在滚水中加热10分 钟,当即用自来水冷却,在插手20ml蒸馏水,混匀,于分光光度计上520nm 测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液取代,其他步调同上。 果胶酶发酵合成及其诱导动物抗病性研究 (5)酶活力单元定义:在上述反映前提下,每分钟转化聚半乳糖醛酸生成 !umol半乳糖醛酸所需的酶量为一个活力单元。 2.2.3紫外接收法测定果胶裂解酶活性[1071 (I)道理:在果胶裂解酶的感化下,果胶裂解构成双键,在235二 有特征 接收。在尝试前提下,双键的生成量和紫外接收成反比关系,以次来评价该酶的 活性 (2)测定方式:将酷化果胶消融于0.05MpH6.0的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲 液溶液中,配制成0.25%的果胶溶液。取2.5ml于石英比色皿中,插手恰当稀释 的酶液0.1ml,搅匀,以纯底物溶液为空白比色,于室温25C,235nm下每30s 测一次吸光度。测至3min。以每分钟吸光度值变化。.O1A为1个酶活力单元。 23次要培育荃和菌种 2.3.1次要培育基的制备 马铃薯葡萄糖琼脂 ((PDA)培育基:见文献1【08]. 果胶琼脂培育基:果胶2%,硫酸钱。,%,磷酸氢二钠。.03%,磷酸二氢 钾。.01%,琼脂2%,121℃灭菌20min. 甜菜渣琼脂培育基:甜菜渣粉末4%,硫酸钱0.9%,磷酸氢二钠0.03%, 磷酸二氢钾0.01%,琼脂2%,121℃灭菌20mina 果胶液体培育基:果胶2%,硫酸钱。,%,磷酸氢二钠0.03%,磷酸二氢 钾0.01 ,用自来水消融。121℃灭菌20min. 果胶土豆汁液体培育基:果胶2%,硫酸按0.9%,磷酸氢二钠0.03%,磷 酸二氢钾0.01%,用土豆汁消融。121℃灭菌20min. 甜菜渣液体培育基:甜菜渣粉末4%,硫酸按0.9%,磷酸氢二钠0.03%, 磷酸二氢钾0.01 ,用自来水消融0121℃灭菌20mina 甜菜渣土豆汁液体培育基:甜菜渣粉末4%,硫酸按0.9%,磷酸氢二钠0.03 %,磷酸二氢钾0.01%,用土豆汁消融。121℃灭菌20min. 甜菜渣固体培育基poi:甜菜渣(干重)20%,硫酸钱1.9%,磷酸氢二钠0.3 %,磷酸二氢钾0.1%,水78 ,每只500ml三角瓶中装干料log。其他废渣培 养基:制备方式同甜菜渣培育基,只是将甜菜渣用其他废渣替代。 第 _章 微生物发酵合功效胶酶 2.3.2次要菌种 溜曲霉(Aspergillustamatii)827:是我们尝试室从天然界分手、筛选出的- 株可间接操纵纤维素等非淀粉类生物多糖的高活性菌株。该菌株保具有含甜菜废 粕粉20g/l;硫酸钱2.5g/l;磷酸氢二钠 (Na2HP0412H20)1.09/1;磷酸氢二钾 0.5g/l的琼脂斜而或Czapek斜面 (培育基书)。每六个月转接一次。 黑曲霉 (Aspergillusniger)PE-1650:是作者从情况平分离、筛选出的一株 果胶酶高产菌株。该菌株保具有PDA培育基斜面,每六个月转接一次。 草酸青霉 (Penicilliumoxalicum)BZH-2002:是作者从情况平分离、筛选出 的一株果胶酶高产菌株。该菌株保具有PDA培育基斜面 每六个月转接一次。 2.4果胶酶出产菌的筛选及形态察看 别离用果胶琼脂培育基和甜菜渣琼脂培育基倒平板,在敞开系统中培育7天 摆布,当培育基上有大量微生物发展后,挑选出发展兴旺的菌株,在甜菜渣琼脂 培育基平板上分手纯化。从各类土壤中采集土样,用水浸泡并稀释,取少量接种 于果胶琼脂培育基和甜菜渣琼脂培育基平板,筛选劣势菌种并纯化。将纯化的各 株微生物别离接种在甜菜渣固体培育基上,置于霉菌培育箱中,30`C,相对湿度 75%,静态培育72h。将发酵好的培育物用3倍分量的水浸泡30mitt,压榨过滤, 获得浸提液,测定浸提液中果胶酶活性,计较出果胶酶的产率。筛选出发酵产率 最高的菌株。 将筛选到的微生物接种到土豆琼脂培育基平板上,察看菌削发展环境。菌落 发展较着后,用接种针挑取少许于载玻片上,用心理盐水稀释,加盖玻片,在显 微镜下放大察看并拍照。按照需要,放大到分歧倍数。 2,5微生物发醉合功效胶酶 2.5.1溜曲霉827果胶酶发酵及粗酶液制备 采用甜菜渣固体培育基,不灭菌,每log甜菜渣配制的培育基装入一只500 mi三角瓶中,接种溜曲霉827斜面菌种,置于霉菌培育箱中,情况相对湿度75% 摆布,30℃恒温静置培育,在培育24小时后,扣瓶一次,总培育时间72小时。 培育竣事后,在室温下每瓶发酵后熟物中插手50ml去离子水浸提1h}100目 尼龙纱布挤压过滤,收集滤液;滤渣再用30ml去离子水浸提一次,再挤压过滤, 果胶酶发酵合成及共诱导动物抗病性研究 收集滤液;两次滤液归并,于离心计心情上3000rpm离心10min,上清夜即为粗酶 液。以下尝试的粗酶液制备过程与该方式不异。 2.5.2黑曲霉PE-1650果胶酶发酵前提的优化 (1)分歧温度下的产酶发展曲线的测定。采用甜菜渣固体培育基,接种黑 曲霉PE-1650,别离在分歧温度下静态培育,别离测定分歧培育时间的果胶酶产 弃二‘ (2)单要素尝试:别离称取10g甜菜渣置于500ml三角瓶中,别离变化 水、硫酸铰、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、接种量等5个要素中的1个,固定其他 4个要素,进行发酵产酶尝试,找出每个要素的最佳程度。 (3)正交尝试优化培育基配方:按照单要素试验的初步成果,采用肠(30) 卜交表设想正交试验。 (4)碳源的选择:以硫酸钱为氮源,别离以甜菜渣、葵花盘、橘皮、苹果 渣、菠萝渣等废渣为碳源,添加少量磷酸盐,制备成固体培育基,接种黑曲霉 PE-1650菌株,300C,相对湿度75%,静态培育72he按照溜曲酶827果胶酶的 提取方式将提取发酵熟物中的果胶酶,测定粗酶液液中果胶酶活性,计较出果胶 酶的产率。选出果胶酶产率最高的碳源。 (5)参照前4步优化发酵前提的尝试成果,以味精废水作为氮源和水分进 行果胶酶发酵试验。 (6)氮源的选择:以甜菜渣为碳源,别离以硫酸钱、氯化钱、硝酸钱、硝 酸钠、鼓皮、豆饼粉、谷氨酸钠、味精废水等为氮源,添加少量磷酸盐,制备成 固体培育基,接种黑曲霉PE-1650菌株。300C,相对湿度75%,静态培育72ha 按照溜曲酶827果胶酶的提取方式将提取发酵熟物中的果胶酶,测定粗酶液液中 果胶酶活性,计较出果胶酶的产率。选出果胶酶产率最高的氮源。 2.5.3草酸青霉BZH-2002果胶酶发酵前提的优化 (1)单要素尝试:别离称取10g甜菜渣置于500ml三角瓶中,别离变化 水、硫酸按、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、温度、接种量等7个要素中的工个,固 定其他6个要素,进行发酵产酶尝试,找出每个要素的最佳程度。 (2)核心组合设想尝试:按照单要素试验的初步成果,设想一核心组合要素 程度表,进行发酵尝试。 第二章 微生物发酵合功效胶酶 (3)碳源的选择:以硫酸钱为氮源,别离以甜菜渣、葵花盘、橘皮、苹果 渣、菠萝渣等废渣为碳源,添加少量磷酸盐,制备成固体培育基,接种草酸青霉 BZH-2002菌株,30C,相对湿度75%,静态培育72ha按照溜曲酶827果胶酶 的提取方式将提取发酵熟物中的果胶酶,测定粗酶液液中果胶酶活性,计较出果 胶酶的产率。选出果胶酶产率最高的碳源o (4)氮源的选择:以甜菜渣为碳源,别离以硫酸钱、氯化钱、硝酸钱、硝 酸钠、数皮、豆饼粉、谷氨酸钠、味精废水等为氮源,添加少量磷酸盐,制备成 固体培育基,接种草酸青霉BZH-2002菌株,300C,相对湿度 75%,静态培育 72h。按照溜曲酶827果胶酶的提取方式将提取发酵熟物中的果胶酶,测定粗酶 液中果胶酶活性,计较出果胶酶的产率。选出果胶酶产率最高的氮源。 2.5.4液态发酵制备果胶酶初试 将筛选出的果胶酶高产菌株黑曲霉PE-1650和草酸青霉BZH-2002菌株,分 别接种于果胶液体培育基、果胶土豆汁液体培育基、甜菜渣液体培育基和甜菜渣 土豆汁液体培育基,在30℃恒温摇床200rpm震动培育,每隔一段时间取一次样, 测定果胶酶活力。绘制发展曲线.成果和会商

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